循环DNA

循环核酸最早由 Mandel和Metais于1947年发现（Les acides nucl´eiques du plasma sanguin chez l’homme[J]. C R Hebd Seances Acad Sci (Paris), 1948, 142(3): 241-3），但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，和特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，使这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展。自发现血中游离DNA可含肿瘤细胞DNA相同基因突变后，应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究的兴趣日益增加。

1.在两个1.5ml离心管（用户自备）中加入20µl蛋白酶K贮存液，再加入200µl同一个血浆样本。

*不要将蛋白酶K直接加入到BufferVL中。

2．分别加入200µl含CarrierRNA的BufferVL，旋涡振荡约15秒混匀。

3.将离心管置于56°C水浴10分钟。

4.分别加入320µl无水乙醇，温和地翻转4~6次混合均匀。

*为避免打开管盖时样品间的交叉污染，开盖前可低速离心数秒，使管盖上的溶液沉降到管底。

5.吸取步骤4中的一管混合液加入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2ml离心管中），盖上管盖，12000rpm离心30秒。

*注意不要将溶液沾到纯化柱管口的边缘上，以免后续的洗涤步骤不能洗净纯化柱。

6．弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将步骤4中的另一管混合液加入到同一个核酸纯化柱中。

*滤液无须彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次。

7．弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500µlBufferWA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。

*确认在BufferWA中已经加入无水乙醇。

8．弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700µlBufferWB,盖上管盖，12000rpm离心30秒。

*滤液无需彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次。

*确认在BufferWB中已经加入无水乙醇。

9．弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。

*如果离心机的离心速度达不到14000rpm，则用最高速离心2分钟。

*请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇而影响后续的PCR效果。

10.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个试剂盒提供的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入25-30µl56℃预热的BufferTE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。

11.弃纯化柱，洗脱的血浆游离核酸可立即用于PCR或RT-PCR检测，或者将血浆游离核酸储存于-20℃备用。

血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。其具体医学应用大致包括以下方面：

1. 用于产前诊断；

2. 用于免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察；

3. 用于肿瘤相关分析。

在上述三类应用中，其在肿瘤分析中的价值尤为重要，虽然目前血中游离DNA分析尚未列为临床必需的检测指标，但数以千计的研究论文和大量一期和二期临床试验的数据，有力支持这一新技术在肿瘤防治中的巨大应用价值：

肿瘤的早期诊断；

肿瘤治疗方案确定；

肿瘤疗效观察；

肿瘤预后评估；

肿瘤转移风险分析；

肿瘤复发监测。